蛋白A/G-微球菌核酸酶(Protein AG-MNase,pAG-MNase)是Protein A/G与微球菌核酸酶(Micrococcal Nuclease,MNase)的融合表达产物,同时具有Protein A/G的抗体结合活性和MNase的核酸内切酶的双重活性,常用于蛋白质-DNA相互作用研究的ChIC和CUT&RUN。
Protein A是一种发现于金黄色葡萄球菌的细胞壁表面蛋白,分子量为42kDa;Protein G是C型或G型链球菌表达的免疫球蛋白结合蛋白。Protein A和Protein G功能相似,能特异性地与哺乳动物免疫球蛋白结合,结合的部位通常为免疫球蛋白的Fc区,但有资料显示Protein A也会和人VH3家族的Fab区结合,而Protein G有时与Fab区也有一定结合。同时,两者对于不同的免疫球蛋白亚类的结合能力有所不同。总体来说,针对大多数抗体,Protein A和Protein G均具有广泛的适用性,具体参考蛋白A+G琼脂糖凝胶(货号:YTB4395)或Protein A+G磁珠(货号:YTB4310)中的相关描述。
MNase(Micrococcal Nuclease)也被称为S7 Nuclease,是一种来源于金黄色葡萄球菌的核酸内切酶,在pH7.0~10.0和Ca2+的条件下可降解单链、双链、线状、环状等多种形式的DNA或RNA,并产生3'磷酸末端的单核苷酸和寡核苷酸。MNase对单链核酸的切割效率比双链核酸更高。MNase在腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)的5'侧的切割效率是鸟嘌呤(G)或胞嘧啶(C)的约30倍,能较好地酶解富含AT或AU区域,所以MNase是“相对”非特异性的核酸内切酶,常用于去除细胞裂解液中的核酸等。另外,MNase仅酶解核小体连接区的DNA,而核小体上的DNA被组蛋白保护而不被MNase酶解。本制品MNase由百奥莱博表达纯化获得的重组蛋白,与天然Staphylococcus aureus的MNase氨基酸序列完全一致,没有额外的标签,没有额外的氨基酸,与天然微球菌核酸酶相比在生化特性方面相同。
CUT&RUN是Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease的首字母缩写,中文名为核酸酶靶向切割和释放,是一种快速、有效、可靠的用于检测细胞中蛋白质与DNA相互作用的技术方法。其主要原理是,将细胞固定在刀豆素A磁珠(ConA磁珠)上,然后用去垢剂如洋地黄皂苷(Digitonin)通透细胞膜,加入特异性的一抗和Protein A-MNase或Protein G-MNase,一抗募集pA-MNase或pG-MNase到染色质的靶蛋白上,然后通过适量浓度的Ca2+来激活MNase,从而切割靶蛋白两侧的DNA并释放切割下来的基因组DNA,后续经纯化、富集的切割下来的基因组DNA片段可通过qPCR检测和定量,也可用于二代测序(NGS)分析。相比于传统染色质免疫沉淀(ChIP),CUT&RUN具有节省时间、所需样品少、NGS测序背景低、实验重复性好等优点,目前广泛用于基因转录调控和表观遗传研究。
本制品降解核酸效果如下图所示。
图1.Protein A/G-微球菌核酸酶降解核酸的效果图。在20μL反应体系中(50mM Tris pH8.0,5mM CaCl2),加入1μg Lambda DNA及相应量的本制品,37℃孵育15分钟,反应完毕后立即置于冰浴,并加入1μL 0.5M EDTA pH8.0以终止反应。加入4μL 6×DNA上样缓冲液(货号:YT418),电泳检测。实际效果会因样品种类、检测仪器等的不同而存在差异,图中效果仅供参考。
一个凝胶单位定义为在37℃下15分钟内消化1μg λDNA所需的酶量,以琼脂糖凝胶电泳测定低分子DNA片段<400碱基对为限。
组分 | 60kU | 300kU |
pAG-MNase(2000gel units/μL) | 30μL | 150μL |
说明书 | 1份 | 1份 |
保存:-20℃,有效期1年。
- 本品含50%甘油,-20℃保存不会冻结。须避免-80℃保存,否则会冻结,反复冻融可能会影响酶的活性。
- 本品较为粘稠,吸取时注意取样量准确,加样后请注意充分吹打混匀,避免产生气泡。
- Ca2+是MNase的关键催化辅助因子,反应缓冲液含有1~5mM Ca2+对MNase的酶活性是必须的,反应溶液中如有EDTA、EGTA等金属离子螯合剂会影响酶活性。
- 反应溶液中盐离子浓度须低于100mM,过高的盐浓度会影响MNase的酶活性。
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